9001-92-7

    已广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面。皮革工业的脱毛和软化已大量利用蛋白酶，既节省时间，又改善劳动卫生条件。蛋白酶还可用于蚕丝脱胶、肉类嫩化、酒类澄清。

    临床上可作药用，如用胃蛋白酶治疗消化不良，用酸性蛋白酶治疗支气管炎，用惮性蛋白酶治疗脉管炎以及用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶对外科化脓性创口的净化及胸腔间浆膜粘连的治疗。加酶洗衣粉是洗涤剂中的新产品，含碱性蛋白酶，能去除衣物上的血渍和蛋白污物，但使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质，引起皮疹、湿疹等过敏现象。

概述：
    水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的月示和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和酸性蛋白酶。按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。

    催化蛋白质水解的酶类。种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。蛋白酶对所作用的反应底物有严格的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键，如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。蛋白酶分布广，主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备。

限量：
    GB 2760—2001：下述条件均GMP为限：蛋白酶(地衣芽孢杆菌)，蛋白质水解、精炼、加工和调味品工业、乳制品；蛋白酶(米曲霉)，蛋白质水解、精炼、加工和调味品工业、乳制品、酿造工业；蛋白酶(枯草芽孢杆菌)，蛋白质水解、精炼、加工和调味品工业、乳制品、酿造工业、焙烤。

毒性：
    由米曲霉制得者可用于食品加工；由弗雷德氏链霉菌制得者撒消原规定；由黑曲霉制得者不作特殊规定，用量以GMP为限(FAO/WHO，1994)。

    蛋白酶的活力测定 蛋白酶由于来源的不同，分为动物性蛋白酶、植物性蛋白酶、细菌性蛋白酶和霉菌性蛋白酶四类。

    动物性蛋白酶的活力测定法，分别见胃蛋白酶和胰蛋白酶。

    植物性蛋白酶的活力测定法，见木瓜蛋白酶，其中方法一亦适用于菠萝蛋白酶和无花果蛋白酶等植物性蛋白酶。

    －、细菌性蛋白酶的活力测定
    1．适用性：本法适用于由枯草杆菌和地衣形芽孢杆菌所得的蛋白酶制剂，其蛋白酶活力以PC单位表示。
    2．基本原理：本法系测定蛋白酶在37℃和pH7.0时，在30min内对酪蛋白的酶解能力。未水解的酪蛋白经过滤后除去，滤液中可溶性酪蛋白的量用分光光度法测定。
    3．试剂和溶液
    (1)酪蛋白：采用优质纯酪蛋白。
    (2)三羟甲基氨基甲烷缓冲液取酶级(或相应级别)的三羟甲基氨基甲烷12.1g，溶于800ml水中，用1mol/L盐酸滴加至pH7.0。移入一1000ml容量瓶中，用水定容后混匀。
    (3)三氯醋酸溶液：取三氯醋酸18g和三水合醋酸钠19g，放入一1000ml容量瓶中，加水800ml使之溶解后，加冰醋酸20ml，再用水定容后混匀。
    (4)底物溶液：取酶级的三羟甲基氨基甲烷6.05g，溶于800mll水中，加1mol/L盐酸8ml，混合。加上述酪蛋白7g使之溶解，再在沸水浴中加热30min，期间偶尔搅动一下。取出，冷却至室温9用0.2mol/L盐酸在强烈搅拌下缓慢地调节至pH7.0，以防酪蛋白沉淀。移入一1000ml容量瓶中，用水定容后混匀。 
    (5)试样液的制备：用三羟甲基氨基甲烷缓冲液制备酶制剂的试样液，使其浓度在下述"操作"中由2ml稀释成最终测定液时，其PC单位在10～44之间。
    4．操作：在3支25mm×150mm的试管中，各加底物溶液10.0ml，其中一支用于酶试液，一支用于酶空白，一支用于底物空白。将所有试管均放于37℃±0.1℃的水浴中恒温15min。迅速吸取试样液加于酶试液管中，同时用秒表记时。混合后将试管重新放入水浴。另取三羟甲基氨基甲烷缓冲液2ml(代替试样液)加入底物空白试管中。各准确地经30min后，在酶试液管和底物空白管中各加三氯醋酸溶液10ml，以终止反应(注意：三氯醋酸溶液不得用嘴吸移)。然后将各管放入水浴中重新加热30min，以使沉淀充分凝聚。
    在第二次加热临将结束时，强烈振摇各试管，并经11cm²的42号滤纸过滤，弃去初滤液3ml。将各试样的滤液(滤液必须完全澄清)于1cm吸收池中，用适当的分光光度计测定其在275nm波长处的吸光度，用底物空白的滤液来校正仪器的零点。减去相应的酶空白液读数以校正酶试液的读数，并将其读数记作A_u。
    5．标准曲线：取预经干燥至恒重的色谱级或相应级别的L-酪氨酸100.0mg，放入一1000ml容量瓶中，加0.01mol/L盐酸液50ml使之完全溶解，再用水定容并彻底混匀。本溶液每毫升含酪氨酸100.0μg。用此作为母液，配制三种每毫升含酪氨酸75.0、50.0μg和25.0μg的稀释液。将上述四种溶液盛于1cm吸收池中，用分光光度计分别测定其在275nm波长处的吸光度，用0.006mol/L的盐酸作对照。据此绘出吸光度与酪氨酸浓度之间的对应曲线。
    6．计算：在上述条件下，每min能产生相当于每毫升1.5μgL-酪氨酸的酶量，称为1个细菌蛋白酶单位(PC)。根据标准曲线，用内插法求出每亳升溶液中含60μg酪氨酸时的吸光度。其值应相当于0.0115。将此由内插法求得的值除以40，即可得酪氨酸浓度为每毫升1.5μg的溶液的相应吸光度，将其值记作A_s。

    二、霉菌性蛋白酶的活力测定
    1．适用性：本法适用于由米曲霉和黑曲霉所制得的蛋白酶。也可用于测定其他蛋白酶在pH4.7时的活力。其蛋白酶活力以酪氨酸基础上的血红蛋白单位(HUT)表示。
    2．基本原理：本法系测定蛋白酶在pH4.7和40℃时，于30min内对血红蛋白底物的酶解能力。未水解的底物用三氯醋酸沉淀后滤去，滤液中可溶性血红蛋白的量用分光光度法测定。
    3．试剂和溶液
    (1)血红蛋白：采用"血红蛋白底物粉"或相似的全溶于水的其他高级品。
    (2)醋酸盐缓冲溶液：取醋酸钠136g，用水溶解后定容至500ml。取该液25.0ml，加1mol/L醋酸液50.0ml，混合后用水定容至1000ml，混匀。本溶液的pH值应为4.7±0.02。
    (3)底物溶液：取上述血红蛋白4.0g，放入一250ml烧杯中，加水100ml，搅拌10min使之溶解。将pH计的电极浸入该溶液，在不断搅拌下，滴加0.3mol/L盐酸至pH 1.7。经10min后，再滴加0.5mol/L的醋酸钠至pH 4.7。将此溶液移入一200ml容量瓶中，用水定容后混匀。本溶液在冷藏条件下可保存5天不变。
    (4)三氯醋酸溶液：取三氯醋酸140g，溶于约75ml水中。将此溶液移入一100ml容量瓶中，用水定容后彻底混匀。
    (5)试样液的制备：取一定量的试样溶于醋酸缓冲液中，使其浓度相当于每毫升9～22HUT(此浓度在下述"操作"中的吸光度读数应相当于0.2～0.5)。
    4．操作：在两支25mm×155mm的试管中，各加底物溶液10.0ml，其中—支用于酶试液．另一支用于底物空白。将各试管于40℃水浴中加热约5min。于酶试液管中加试样液2.0ml，并同时记时；于底物空白试管中加醋酸缓冲液2.0ml，用橡皮塞塞口，用手按紧后摇混30s。将试管放入40℃水浴中准确加热30min，然后立即在各管中加入三氯醋酸溶液10.0ml(注意：不得用嘴吸移)。按紧塞子，强烈振摇约40s，然后冷却1h至室温，在此期间每隔10～12min压紧塞子振摇一次。另按下法制备酶空白液：取二支离心管，一管加底物溶液10.0ml，一管加试样液约5ml，于水浴中加热30min，然后于底物溶液中加三氯醋酸溶液10.0ml，充分振摇40s，再加入已预热的试样液2.0ml。再振摇后冷却1h至室温，期间每隔10～12min振摇一次。
    在1h临近结束时，强烈振摇各管，经11cm的42号滤纸过滤，开始时的一半滤液经同一滤纸重新过滤。将各滤液盛于1cm吸收池中，用一适当的分光光度计测定它们在275nm波长处的吸光度，用底物空白滤液来校正仪器的零点。减去相应的酶空白液读数以校正酶试液的读数，并将其值记作A_u(如校正后的吸光度读数不在0.2～0.5之间，则应改变酶试液的浓度后重新再测)。
    5．标准曲线：取预经干燥至恒重的色谱级或相应级别的L-酪氨酸100.0mg，放入一1000ml容量瓶中，加0.1mol/L盐酸60ml使之完全溶解后，用水定容并彻底混匀。本溶液每毫升含L-酪氨酸100μg。用此作为母液，配制三种每毫升分别含L-酪氨酸75.0、50.0、25.0μg的稀释液。将上述四种溶液盛于1cm吸收池中，用分光光度计分别测定其在275nm波长处的吸光度，用0.006mol/L的盐酸液作为对照。据此绘出吸光度与酪氨酸浓度之间的对应曲线。再根据每微克酪氨酸的吸光度求得该曲线的斜率。将此值乘以1.10，记作A_s。该值应约为0.0084。
    6．计算：在上述条件下，水解产物在275nm波长处的吸光度相当于每毫升0.006mol/L盐酸液中含有1.10μg酪氨酸哟溶液所需的酶量，称为1个HUT酶活力单位。

    注：在严格控制的标准条件下，A_s值应为0.0084。该值在日常作业中可用以代替由标准曲线所得的值，但在有疑问时，仍泣按标准曲线来计算该值，以求得更精确的结果。